7. CUESTIONARIO O ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS.
PRELABORATORIO:
• Revisar en atlas de microbiología o micología tanto en medio impreso como virtual, las
estructuras que se observan en el examen directo de las micosis sistémicas endémicas
• ¿Cómo es la forma de informar los diferentes exámenes directos de las micosis sistémicas
endémicas?
Al examen directo se observan levaduras multigemantes de Paracoccidioides brasiliensis.
• ¿Cuál es la temperatura a la que se debe incubar el cultivo para obtener las estructuras de la esporulación que permiten identificar P. brasiliensis e H. capsulatum?
.
P. brasiliensis: Para obtener la forma fi lamentosa se llevan a cabo en Sabouraud, Sabouraud con antibióticos y extracto de levadura agar a 28°C; también son útiles gelosa sangre y gelosa chocolate, adicionados de extracto de levadura; si se incuban a 37°C se obtiene la forma levaduriforme. El tiempo de desarrollo es variable; las colonias se observan de 3 a 4 semanas hasta 2 o 3 meses. Los resultados de los cultivos sembrados directamente de los pacientes son inconstantes. Las características micológicas serán tratadas con posterioridad.
Medios enriquecidos: agar Borelli, agar harina de amaranto, agar tierra de jardín, agar de Czapek-Dox
.
H. capsulatum: A fi n de obtener la fase fi lamentosa, se debe sembrar en agar Sabouraud o agar extracto de levadura a 25°C, y trabajarse en campana de bioseguridad nivel III. Se obtienen colonias casi indistinguibles de la variedad capsulatum. La diferencia radica en que Histoplasma capsulatum var. duboisii es ureasanegativa. Los cultivos en fase levaduriforme (gelosa sangre a 37°C) también son bastantes similares a los de la variedad capsulatum. Al microscopio H. capsulatum var. duboisii presenta blastoconidios de diferentes tamaños, pero en general son más grandes (1-2 a 5-10 μm).
• ¿Qué importancia tienen las intradermorreacciones en el diagnóstico de las Micosis Sistémicas Endémicas?
muy específi ca, una respuesta positiva indica infección; si existen lesiones importantes y es positiva, indica buen pronóstico pero si es negativa y acompaña a títulos altos de anticuerpos fi jadores de complemento, el pronóstico es malo. Algunas, como la histoplasmina y la paracoccidioidina, generan reacciones cruzadas entre sí.
fúngicos de forma intradérmica tiene como fi nalidad evaluar la respuesta inmunológica tipo IV; se usan para fi nes epidemiológicos o para el transcurso de la enfermedad. Los antígenos más utilizados para diagnóstico de micosis son histoplasmina, coccidioidina (preferible la esferulina), paracoccidioidina, esporotricina (micelial para diagnóstico y levaduriforme para epidemiología) y tricofi tina; otro tipo de antígenos extraídos de cultivos de hongos son más usados para evaluar respuestas frente a diversos aeroalergenos (antígenos de Aspergillus niger, Cladosporium cladosporioides, Alternaria alternata, etc.); éstos son más utilizados como cutirreacciones que evalúan inmunidad tipo I (hipersensibilidad).
POSTLABORATORIO:
1. Realice el algoritmo correspondiente al diagnóstico de laboratorio de las diferentes Micosis Sistémicas Endémicas.
Paracoccidioidomicosis
biometría hemática,
sedimentación globular,
pruebas de función hepática (con cifras de α-glutamiltransferasa),
pruebas de función renal,
electrólitos séricos,
radiografías de tórax y ecografía abdominal.
Se practica intradermorreacción con paracoccidioidina, antígeno obtenido de la fase levaduriforme del hongo. Una prueba positiva mide más de 10 mm e indica hipersensibilidad; en pacientes graves, una prueba negativa significa anergia; suele haber resultados falsos positivos en histoplasmosis y coccidioidomicosis.
Se puede usar la citología exfoliativa sin necesidad de una tinción especial adicional
La detección de anticuerpos y antígenos es importante en el diagnóstico, y en la vigilancia del tratamiento.
con enfermedad reciente, las concentraciones de IgE, IgG y las fracciones β y α2 de globulinas son altas, las de IgM son normales, y las de IgA, variables
Los antígenos que se derivan de la pared dan mucha reactividad cruzada, por los galactomananos; son más útiles los antígenos derivados de cultivos fi ltrados o citoplasmáticos. Los antígenos de cultivos fi ltrados (metabólicos) E1 y E2 son los más específi cos; este último es análogo de la glucoproteína de 43 kDa, pero puede mostrar reacción cruzada con Histoplasma capsulatum y Lacazia loboi.
Las pruebas de precipitación aparecen en etapas tempranas y se negativizan con el tratamiento. La fi jación del complemento es de aparición tardía, en individuos con lesiones activas, los títulos de 1:8 indican infección, y los títulos altos, diseminación; tiene sensibilidad de 70 a 100% y especifi cidad de 60 a 90% con un valor predictivo positivo cidad de 60 a 90% con un valor predictivo positivo de casi 80%; luego de su disminución con la mejoría, un aumento indica recurrencia. La inmunodifusión en agar tiene sensibilidad de 90% y especifi cidad de 100%; es mejor si se realiza con antígeno de cidad de 100%; es mejor si se realiza con antígeno de la fase de levadura (fi gura 18-11); una prueba positiva indica infección activa aun en ausencia de síntomas. Se presentan 1 a 3 bandas de precipitación que se correlacionan con la gravedad de la enfermedad y con la fi jación del complemento; las bandas 1 y 2 son específi cas, y la 3 tiene reacción cas, y la 3 tiene reacción cruzada con Coccidioides sp.; éstas disminuyen en número e intensidad con el tratamiento. La inmunodifusión y la fi usión y la fi jación del complemento tie- jación del complemento tienen sensibilidad de 71 a 100%, pero la especifi cidad resulta menos satisfactoria; por lo general son útiles para establecer el pronóstico. Ante afección de sistema nervioso central, el líquido cefalorraquídeo puede mostrar leucocitosis con predominio mononuclear, así como las levaduras. También se pueden realizar inmunoelectroforesis, enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA), inmunoelectrotransferencia Western (Western blot), contrainmunoelectroforesis, ), contrainmunoelectroforesis, aglutinación e inmunofl uorescencia indirecta, antígeno re- uorescencia indirecta, antígeno recombinante de 27 kDa para transferencia en mancha (dot blot), inmunofl uorescencia inversa y amplifi uorescencia inversa y amplifi cación isotér- cación isotérmica mediada por asa (LAMP, del inglés loop-mediated isothermal amplifi cation). En algunos centros hospitalarios se considera a la contrainmunoelectroforesis la mejor técnica diagnóstica porque cuenta con sensibilidad de 77 a 100% y especifi cidad cercana a 100%, además de ser rápida y fácil de ejecutar. La detección de antígenos (Gp43) es importante, en especial en sujetos con inmunodefi ciencia (SIDA); los antígenos ciencia (SIDA); los antígenos también pueden detectarse con anticuerpos monoclonales; se identifi e identifi can en suero en casos crónicos y agudos, y en ori- can en suero en casos crónicos y agudos, y en orina en casos agudos. La glucoproteína Gp43 en pruebas de inmunodifusión es la prueba serológica más usada para el diagnóstico y el seguimiento del tratamiento, con especifi - cidad de 100% y sensibilidad de 90%; es mejor si se emplean antígenos de la fase de levadura. También se ha empleado inhibición de inmunoensayo enzimático (enzyme immunoassay inhibition) con las moléculas de 43 y 70 kDa en lavado bronquial, y estudio de citología exfoliativa de lesiones orales con una sensibilidad de 68 a 100% y especifi cidad de 92%. En ratones infectados se ha usado blanco de calcofl úor para estudios de fl udios de fl uorescencia
Histoplasmosis
La histoplasmina es un antígeno que se obtiene de la fase micelial; una respuesta positiva indica infección presente (con reacción a partir de las 4 a 8 semanas de la infección) o pasada. Se inyecta 0.1 ml por vía intradérmica a una dilución de 1:100 a 1:1 000; la lectura en 48 h se considera positiva si existe induración mayor de 5 mm; presenta reacción cruzada con blastomicosis y coccidioidomicosis; por ello carece de gran utilidad diagnóstica, pues resulta positiva en 50 a 80% en habitantes de áreas endémicas, y es negativa si la enfermedad es diseminada. Su aplicación puede ocasionar aumento de la fi jación del complemento. Una variedad del antígeno, la histolisina, es más sensible. Las pruebas inmunoserológicas para detección de anticuerpos son la fi jación del complemento y la inmunodifusión, que pueden mostrar reacción cruzada con Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis y Penicillium marnefeii, y para valoración de antígenos polisacáridos, el inmunoensayo enzimático (enzime immunoassay) que se puede llevar a cabo en líquidos corporales, como sangre, orina, líquido de lavado broncoalveolar y LCR. Debido a que los antígenos de H. capsulatum presentan reacción cruzada con los galactomananos séricos de Aspergillus, se ha propuesto su determinación como método de monitoreo cuando no se dispone de otras herramientas. La fi jación del complemento es positiva a las 2 a jación del complemento es positiva a las 2 a 4 semanas de la infección. Deben tomarse en cuenta títulos de 1:8 a 1:16; éstos aumentan si se presenta diseminación, y son positivos en 87%; los títulos de 1:32 indican enfermedad activa o progresiva. En general, la recuperación clínica es paralela a la negativización. La inmunodifusión en gel es positiva a las 3 o 4 semanas de la infección y se hace negativa con la curación o en dos años; cuando la infección es reciente o hay recuperación, se encuentra una banda M que aparece en 75% de los pacientes, y puede persistir años después de la involución del proceso. En enfermedad activa, existe una banda H muy cercana al suero, sólo demostrada en 25%; la banda C también puede depender de B. dermatitidis (fi gura 17-10). En H. duboisii se pueden determinar fi minar fi jación de com- jación de complemento e inmunodifusión radial.
La prueba de aglutinación con látex es positiva en enfermedad reciente; la inmunofl uorescencia directa con uorescencia directa con anticuerpos fl uorescentes se lleva a cabo en un frotis, y es específi ca en estas levaduras. El radioinmunoensayo (RIA, ca en estas levaduras. El radioinmunoensayo (RIA, del inglés radioimmunoassay) es dos veces más sensible; detecta IgG, pero tiene poca especifi cidad. Se ha dicho que cidad. Se ha dicho que la prueba de enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA) tiene especifi cidad de 91% y es útil en casos de histoplas- cidad de 91% y es útil en casos de histoplasmosis pulmonar o diseminada progresiva, pero es inútil en inmunodefi cientes (en quienes resulta mejor emplear la cientes (en quienes resulta mejor emplear la fi jación de complemento). Asimismo, es posible emplear electrotransferencia Western (Western blot), que también es sensible, pero muestra ), que también es sensible, pero muestra reacción cruzada con las otras micosis. El antígeno recombinante de 60 kDa, cuando se usa con inmunoelectrotransferencia, es reconocido por 100% de sueros con histoplasmosis. Aun constituyen un problema los resultados falsos positivos en pacientes expuestos con anterioridad al hongo, y los falsos negativos en inmunodefi cientes. Es probable que la cientes. Es probable que la detección de antígenos en orina sea lo mejor para el diagnóstico (además de que se correlaciona con la evolución de la enfermedad). Con RIA se pueden detectar en orina y suero, y quizá sea más específi co con aplicación de anticuerpos co con aplicación de anticuerpos monoclonales. Por estudios sistemáticos en las formas diseminadas pueden observarse incremento de la sedimentación globular, de la concentración de fosfatasa alcalina y de ferritina, y pancitopenia.
Coccidioidomicosis
La intradermorreacción se practica con coccidioidina o esferulina; la primera es un antígeno micelial obtenido por fi ltración y estandarizado a 1:100, y la segunda, más sensible, es un polisacárido que se encuentra en el sobrenadante citoplasmático de esférulas cultivadas y rotas por ultrasonido. En áreas endémicas, se observan poblaciones con reacciones positivas que varían de 10 a 90% (históricamente, entre 1961 y 1965; de acuerdo con González Ochoa, las reacciones positivas en la franja fronteriza de México van de 50% en Sonora y decrecen con rumbo al este; en Tamaulipas son de 10%). La reacción se hace positiva a los dos días a tres semanas luego del inicio de los síntomas, y persiste así durante años; en presencia de síntomas, una reacción positiva indica buen pronóstico (inmunidad celular adecuada), y una negativa, mal pronóstico (anergia). Esta prueba no se encuentra con facilidad disponible en EUA, pero se comercializa en México. Las pruebas de precipitación en tubo detectan anticuerpos termoestables específi cos de tipo IgM; aparecen durante la primera semana de iniciados los síntomas y sólo persisten algunas semanas; se hacen negativas hacia el cuarto a sexto meses; son muy específi cas e indican enfermedad reciente.
La aglutinación de partículas de látex también es positiva en fases tempranas, manifi esta actividad de IgM, y es positiva en 70% de los enfermos. Los anticuerpos fi jadores de complemento detectan IgG específi cas usando una fracción termolábil; son más tardíos; se detectan tres meses después del inicio de los síntomas y desaparecen en 6 a 8 meses; se encuentran en 90% de los pacientes sintomáticos y en 10% de quienes no tienen síntomas; pueden persistir a títulos bajos durante años. La fi jación del complemento guarda proporción directa con la cantidad de parásitos; los títulos altos y el incremento rápido indican mal pronóstico pues se relacionan con diseminación, enfermedad grave o muerte inminente, y los bajos, buen pronóstico y limitación del proceso. Se encuentran aumentados en sujetos con bronquiectasias o daño meníngeo, y están bajos o no hay ante cavitación o coccidioidoma. La inmunodifusión se torna positiva casi al mismo tiempo que la fi jación del complemento; se observan líneas múltiples en enfermedad activa y una sola línea en infección crónica estable. Con una inmunodifusión positiva, los títulos de fi jación del complemento de 1:2 a 1:8 indican enfermedad activa o reciente, y los de 1:16, diseminada. También se detectan anticuerpos en líquido cefalorraquídeo (LCR), pericárdico, pleural y articular. Por reacción cruzada, el antígeno de histoplasmosis puede resultar positivo. Es posible llevar a cabo vigilancia de la respuesta al tratamiento con técnicas serológicas cuantitativas; las reacciones serológicas falsas negativas ocurren sobre todo en sujetos con alteraciones inmunitarias, con una frecuencia de 86 a 96 por ciento. Otros métodos para el diagnóstico son las técnicas de anticuerpos fl uorescentes (que permiten detectar esférulas in vivo), anticuerpos monoclonales o inmunoensayo enzimático (EIA, del inglés, Enzyme Immunoassay) para detectar antígenos en orina, anticuerpos contra galactomananos, ELISA, aglutinación de partículas de látex, reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction) (más sensible y útil para la identifi cación sistemática) e hibridación in situ (útil cuando hay poca cantidad del hongo o se encuentra en fases tempranas); estas últimas técnicas permiten la identifi cación de C. immitis/posadasii, incluso en tejido fi jado en parafi na. Se ha identifi cado una proteína (del tipo colectina) conocida como lectina de unión a manosa (del inglés Mannose-binding lectin, MBL), la cual se encuentra en concentraciones altas en pacientes con infección asintomática en comparación con los que cursan con enfermedad progresiva o grave, o ambas, y pudiera servir como marcador para el seguimiento. En los estudios generales de laboratorio se encuentran leucocitosis con eosinofi lia, y sedimentación globular alta. Cuando se observa meningitis, el LCR quizá muestre turbidez, pleocitosis, proteínas altas y glucosa baja. En general, la presencia de eosinófi los en cualquier sitio anatómico indica infección progresiva. Se puede hacer determinación de antígenos en líquido de lavado bronquial
Se estudian las mediciones de (1-3) β-d glucano como marcador de progresión en casos de infección diseminada.
Blastomicosis
Se encuentran anemia microcítica, leucocitosis con neutrofi lia, y sedimentación globular acelerada. Los estudios serológicos son poco sensibles y poco específi cos, como fi jación del complemento (que presenta muchos resultados falsos positivos) e inmunodifusión (más sensible y específi ca, de 80% en ambas con sueros recién obtenidos); el inmunoensayo enzimático (EIA, del inglés Enzyme Immuno Assay) tiene sensibilidad de 100% y especifi cidad de 85.6%. La sensibilidad del enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA, del inglés enzyme-linked immunosorbent assay) es de 77%. En laboratorios de referencia en EUA se lleva a cabo una prueba directa de anticuerpos fl uorescentes en estudios serológicos, y también se puede realizar en cortes de tejidos y cultivos levaduriformes. El inmunoensayo enzimático en “sándwich” (sandwich immunoassay) tiene sensibilidad de 88% y especifi cidad de 100%, y el radioinmunoensayo con antígeno de 120 kDa tiene sensibilidad de 85% y especifi cidad de 100%. La inhibición del inmunoensayo enzimático (enzyme inhibition immunoassay) tiene sensibilidad de 93%. Todas estas pruebas tienen sensibilidad y especifi cidad aceptables, pero la gran desventaja de reacciones cruzadas con Histoplasma. Se puede determinar antígeno urinario (no es específi co, cruza con histoplasmosis), β-glucanos, reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction) (fragmento r26S), ITS1, ITS4, D1 y D2. Existen sondas de ácidos nucleicos para formas micelial y levaduriforme. Las sondas de DNA (Gene-probe) se pueden combinar con quimioluminiscencia; son prácticas pues la detección sólo requiere dos horas, y la sensibilidad es de 87.8 a 100%. No hay pruebas cutáneas estandarizadas; por lo general muestran reacción cruzada con Histoplasma capsulatum, y en EUA no están disponibles. La detección de BAD-1, que es una proteína y no un carbohidrato, no presenta dicha reacción cruzada.
2. Con base en el anterior diagrama ilustre los hallazgos de laboratorio en estas Micosis.
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