INTRODUCCION
Los hongos, como las bacterias, pueden ser aislados en medios de cultivos naturales o sintéticos. Estos aislamientos se observan como colonias con características macroscópicas y microscópicas que sirven para la identificación del género y muchas veces de la especie.
Gran parte del éxito en el aislamiento y la identificación de los hongos depende de la adecuada preparación, almacenamiento y utilización de los medios de cultivo y de los reactivos. Estos procedimientos deben seguir las normas establecidas de cantidad, tipo de solvente, esterilización y almacenamiento.
Los medios de cultivo utilizados en micología son sólidos o líquidos. Pueden ser simples, diferenciales, selectivos y enriquecidos, entre otros. El laboratorista debe utilizar un medio de acuerdo con el resultado que necesite obtener: aislamiento primario, identificación bioquímica o determinación de otras características.
El tiempo de crecimiento de los hongos en el medio adecuado varía de acuerdo con su género y especie; por ejemplo los mohos aseptados tardan de 24 a 48 horas, las levaduras de 3 a 5 días, los dermatofitos de 10 a 20 días y los agentes de las micosis profundas pueden tardar de 4 a 5 semanas. Esto debe tenerse en cuenta para el seguimiento y el informe oportuno del resultado.
OBJETO DE ESTUDIO
Medios de cultivo, reactivos y coloraciones de uso en micología
OBJETIVOS DEL TALLER:
Identificar los medios de cultivo, reactivos y coloraciones empleados en el estudio de los hongos y el diagnóstico de enfermedades micóticas
Distinguir el uso de los diferentes medios de cultivo, reactivos y coloraciones empleados en el laboratorio de micología
Conocer el fundamento de los medios de cultivo, reactivos y coloraciones utilizadas en micología
COMPETENCIAS A ADQURIR POR EL ESTUDIANTE
El estudiante conoce el fundamento y uso de los medios de cultivo, reactivos y coloraciones utilizadas en micología.
METODOLOGIA:
Desarrollo y socialización del cuestionario
Presentación del profesor: examenes directos con diferentes reactivos y coloraciones, crecimiento de colonias de hongos en diferentes medios de cultivo, estructuras observadas a partir de cultivos con reactivos específicos para este uso.
Uso de la información para la elaboración del primer informe práctico.
CUESTIONARIO
¿Qué ventajas proporciona la implementación de un estricto control de calidad de medios de cultivos y reactivos en el laboratorio de micología?
Evita falsos negativos y falsos positivos, asegura el diagnóstico y confirma un pronóstico
Permite que los resultados emitidos por el laboratorio sean confiables.
¿cómo se hace?
El sitio de preparación debe ser completamente estéril, se deben respetar las concentraciones o cantidades de sus componentes (soluto y solvente), el Ph debe ser el adecuado entre 5 y 6.
T° 18 a 25 °
Control de calidad en medios de cultivo para controlar la apariencia, esterilidad, pH, funcionamiento: el funcionamiento con las cepas de control para cada medio.
Para reactivos, etiquetas de caducidad
¿Cómo se realiza el control de calidad interno de las diferentes tinciones que se utilizan para el examen directo de muestras sospechosas para investigación de hongos?
Examen en fresco con clarificación por KOH
En el momento de su preparación comprobar su actividad por la capacidad de disolver una porción de muestra de esputo, ya que el KOH lo que hace es disolver las estructuras, las proteínas de la pared micótica, se usa esputo porque tiene muchas proteínas, lípidos etc. Por lo que es un buen control
En el momento del uso diario hay que realizar un control visual macroscópico de ausencia de precipitados y de contaminación. Disuelve rápidamente las células permitiendo digerir material proteico, observando con mayor nitidez los elementos fúngicos, su efecto de clarificar puede incrementarse al calentar a la llama ligeramente la preparación. Adicionalmente, se puede emplear colorantes para pigmentar la pared de los hongos y mejorar la visualización. La observación de hifas, permite sugerir la presencia de invasión micótica. No debe haber precipitado, positiva, tiene los mismos componentes de los hongos, esputo simulaba el hongo
Los controles se realizan cada vez que se prepara un lote nuevo de reactivo y cada vez que se realiza la tinción. Utilizar Candida albicans en suspensión acuosa para el control positivo y una suspensión en solución salina de Escherichia coli para el control negativo.
Es una tinción fluorescente con gran afinidad por la quitina de la pared fúngica que no requiere fijador ni medio de transporte para su análisis, por lo que su interpretación puede ser inmediata. Se usa para hongos filamentosos (mohos) que NO se tiñen con Gram. Ej: Aspergillus, Penicillium-
Coloración Giemsa Es de utilidad para el diagnóstico de histoplasmosis, neumocistosis y otras micosis. Permite visualizar blastoconidias intracelulares al polimorfonuclear, como la fase tisular del H. capsulatum.
Tinción de tinta china para la observación de la cápsula polisacárida de Cryptococcus spp.
Cada vez que realicemos la técnica comprobar la esterilidad del reactivo y añadir un control positivo a partir de una suspensión acuosa de Cryptococcus albidus. Es un método de contraste. Permite visualizar la cápsula de polisacárido de Cryptococcus neoformans, mediante la presencia de un halo claro y nítido alrededor de la levadura. Existen artefactos (hematíes, burbujas de aire, leucocitos, gotas de grasa y partículas de talco) que pueden interferir y confundir al analista. La sensibilidad de la técnica es de 50% en pacientes sin VIH y se puede incrementar hasta 88% en pacientes VIH con meningitis criptococósica.
Coloración Gram Es útil para observar blastoconidias y pseudomicelios de las especies del género Candida, Malassezia y Cryptococcus, las cuales son Gram positivas con variaciones en la intensidad de la coloración. Hongo filamentosos
Tinción con azul de lacto fenol
Hay que comprobar la esterilidad del reactivo cada vez que se utilice. Es una tinción que se utiliza con un doble propósito, como tinción y como solución de montaje. Sus componentes actúan matando al hongo pero preservando la estructura al mismo tiempo que se tiñe de azul. Procesamiento de cultivo
No es necesaria la utilización de controles positivos y negativos, es suficiente con comprobar que las estructuras fúngicas se tiñen de color azul.
Etanol al 70 %
benzoato
¿Diga tres condiciones que se deban cumplir para contar con un medio de cultivo de calidad adecuada?
Concentración alta de carbohidratos y una fuente de nitrógeno
El Ph debe oscilar entre 5 y 6
Temperatura de incubación entre 15 y 37 °C
Esterilidad
Temperatura de almacenamiento:
Las condiciones ambientales requeridas para desarrollar los ensayos relacionados con la Micología Médica son similares a las de cualquier laboratorio de Microbiología. Sin embargo, existen ciertas peculiaridades que deben considerarse a la hora de realizar la manipulación de muestras clínicas y de hongos patógenos. ¿Qué consideraciones de bioseguridad y de limpieza deben tenerse en cuenta en el laboratorio de micología?
Si se sospecha que la muestra proviene de un paciente con infección por un hongo de nivel de peligrosidad 3, el laboratorio debe contar con las condiciones de bioseguridad nivel 3 para procesar esa muestra, además para los cultivos de hongos filamentosos se debe contar con una cabina de bioseguridad para evitar contaminaciones cruzadas dentro del laboratorio.
Hongos nivel 3: C, neoformanas, histoplasma capsulatum
La limpieza en las zonas de cultivos se realiza con etanol al 70%, desnaturaliza las proteinas
Las estufas con halacid al 1%, bencilbenzoato al 20% ó con formalina si está permitido.
Revise la información acerca de los medios de cultivo, reactivos y coloraciones empleados en micología y agrúpelos con base en su uso y/o características afines.
Mohos negros: Cladosporium spp, Epicoccum spp, Sporobolomyces spp, Stemphylium spp
Medio de Jelli: para el montaje de placas de cultivo
Agar urea de Christensen: para diferenciar criptococcus de otras levaduras
En el Gram las levaduras se ven gram positivas, moradas
MEDIOS DE CULTIVO
Medio saburoaud modificado con glucosa
Aislamiento y desarrollo de los hongos, particularmente los asociados a infecciones cutáneas como piel y pelo. la peptona tripteína y la glucosa son los nutrientes. Alto contenido de glucosa, presencia de cloranfenicol, y pH ácido, inhiben el desarrollo bacteriano, favorecen creciemiento de los hongos y levaduras. Para hongos patógenos y saprofíticos. Especialemte levaduriformes. Este agar es el ASD más un antifúngico (cicloheximida =actidiona). Se utiliza para aislamiento primario de la mayoría de los hongos patógenos en los cuales se incluyen los dermatofitos.Son ejemplos de este medio, el medio Mycosel, Dermacel, Mycobiotic.
Saburoaud dextrosa
Para hongos patógenos y no patógenos. Bajo pH para crecimiento de hongos, ligeramente inhibe las bacterias. Se puede agregar gentamicina , inhiben gramnegativos o cloranfenicol amplio espectro. El ASD se usa para el aislamiento primario de hongos ambientales y oportunistas y no se recomienda su uso de rutina para aislar los hongos patógenos primarios, porque estos tienen un crecimiento más lento que el de los hongos ambientales.
Caldo dextrosa de sabouraud
Este medio líquido es de utilidad para transportar muestras tomadas con hisopo y, con ello, evitar la desecación y pérdida de viabilidad de los microorganismos que se pretende recuperar; para esto se pueden utilizar tubos de 13 (3) 100 mm con 1 o 2 ml de caldo estéril. Este medio es también útil para reactivar cepas de hongos en medios ligeramente deshidratados, o bien para primocultivo de levaduras.
Agar dextrosa de Sabouraud (ADS) y agar extracto de levadura (AEL)
Los medios sólidos de ADS y AEL son los óptimos para el aislamiento rutinario de cepas de hongos; se deben incubar a 25-28°C; sin embargo, tienen el inconveniente de que pueden presentar fácilmente contaminación bacteriana debido a que no contienen antibióticos. Ambos medios se consideran más útiles para el aislamiento de hongos de micosis de tipo oportunista.
Agar Sabouraud con antibióticos (agar para aislamiento de hongos patógenos)
También se trata de un medio rutinario para el aislamiento de diversos hongos; se sugiere sembrarlo a la par en ADS o AEL. En general este medio permite el desarrollo sólo de hongos patógenos primarios, e inhibe el desarrollo de la mayoría de bacterias (por el cloranfenicol) y hongos mohos contaminantes (por la cicloheximida); es importante señalar que cuando se siembran muestras de pacientes con sospecha de candidosis, algunas especies como C. tropicalis son resistentes a la cicloheximida, lo cual puede ser un dato orientador al tipifi car los aislados de estas levaduras.
agar sangre
Cuál es el pH óptimo de los medios de cultivo para hongos?. Qué efecto adicional positivo tiene este pH en el aislamiento de los hongos?
El Ph óptimo de los medios de cultivo para hongos es entre 5 y 6, adicionalmente este Ph inhibe el crecimiento bacteriano que puede contaminar el cultivo.
Diga en el diagnóstico de qué tipo de infecciones micóticas son útiles los medios cromogénicos?
En infecciones mixtas y en infecciones por levadduras
Verde: C, albicans
Azul: C, tropicali
Rosadas: C, krusei
En el diagnóstico de las micosis, diga cuál es el aporte de los hemocultivos automatizados por el método de lisis centrifugación?
El aporte de …. Es que disminuye el tiempo de reporte de resultados especialmente en micosis invasoras o fungemias.
Consiste en un tubo de lisis cuyo contenido es polianetol sulfonato de sodio como anticoagulante, saponina como agente lítico de eritrocitos, leucocitos y macrófagos, polipropilenglicol como antiespumante y un fluoroquímico inerte de alta densidad. Luego se somete a la muestra a una centrifugación a alta velocidad que permite la concentración de microorganismos en el sedimento que se siembra en medios de cultivo específicos. En general, este método permite mejorar en un 25 a 50% la detección de hongos levaduriformes y filamentosos
Cómo haría el control de calidad del medio Agar sabouraud dextros-SDA
Medio de cultivo color ámbar, transparente, sólido y sin precipitado, con un ph de 5.6 + o – 2. Para el control de crecimiento se usa candida albicans, saccharomyces cerevisiae, aspergillus brasiliensis, trichophyton mentagrophytes y para el de inhibición S, aureus y E, coli.
Por qué el medio SDA modificado debe utilizarse simultáneamente con otros medios?
El medio SDA modificado debe usarse junto a otros medios porque inhibe muchos hongos de importancia clínica al contener cicloheximida, como Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp, penicillium spp y mohos aceptados.
Al momento de realizar un cultivo, cómo aprovecharía las diferencias existentes en la composición del sabouraud simple y el sabouraud modificado?
Aprovecharía esas diferencias dependiendo la muestra que vaya a procesar, si es una muestra de un lugar con contaminación bacteriana usaría el SDA modificado, ya que posee cloranfenicol que inhibe muchas bacterias. Si la muestra es de un sitio con poca o ninguna contaminación bacteriana (estéril) usaría el SDA simple.
El SDS contiene mas dextrosa 40%, por lo que inhibe algunas bacterias y algunos hongos, se usaría para aislar tanto patógenos cómo no patógenos. El medio SDM tiene 10% de dextrosa y posee cloranfenicol que inhibe el crecimiento bacteriano y cicloheximida que inhibe a hongos saprofitos, por lo que se usaría para aislar hongos patógenos.
Mencione la utilidad de los componentes de la tinción de azul algodón de lactofenol.
Es útil para observar estructuras fúngicas provenientes de cultivos, son permanentes y se pueden sellar con esmalte de uñas por un año.
Fenol. Mata al hongo
Ácido láctico: agente aclarante que preserva la estructura del hongo
Glicerina: previene la desecación
Azul de algodón: colorea la quitina y celulosa del hongo
Al procesar el examen directo y cultivo para estudio micológico de una muestra clínica, qué diferenciación haría usted en el uso del KOH al 10% y el azul de lacto fenol?
– para el examen directo (muestras con material queratínico, raspados de córnea) se usa el KOH al 10% y para el cultivo el azul de lactofenol
Revise el fundamento de las siguientes coloraciones: Ácido peryodico de Schiff (PAS), calcofluor blanco, plata- metenamina de Gomori (GROCOTT)
Ácido peryodico de Schiff: Este método esta basado en la propiedad que tienen los mucopolisacáridos neutros,presentes en la pared celular de los hongos, de oxidarse en presencia del acido peryódico al formar aldehídos. Estos aldehídos fijan la fucsina de schiff, que recobra su color rojo en presencia de ellos.
Oxida los mucopolisacaridos de la pared formando aldehídos, estos fijan la fucsina de schif se tiñe de rojo el hongo.
Calcofluor blanco: Es un colorante fluorocromico que se une a la quitina y celulosa de la pared de los hongos. Los organismos transmiten una fluorescencia cuando se excitan con luz UV (mayor de 410-450 nm) por lo que se necesita un microscopio de fluorescencia. El fluorocromo se puede mezclar con KOH para limpiar la muestra y facilitar la observación de elementos fúngicos. Es sensible en el examen directo en muestras con poca carga microbiana como las queratitis micoticas.
plata- metenamina de Gomori (GROCOTT): Entre las coloraciones especiales para hongos la plata metenamina es la másempleada. La reacción tintorial está basada en que en presencia de ácido crómico los grupos hidroxilo de los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; estos, a su vez reducen el complejo nitrato-plata metenamina produciendo la coloración café a negro, debido al depósito de la plata reducida en los lugares de localización de los aldehídos.
El ácido crómico oxida los hidroxilos de los polisacáridos de la pared dando aldehídos, estos reducen el complejo plata metenamina dando un color marron
Diga el fundamento y uso del medio CHROMagar Cándida
Este medio es usado para diferenciar cultivos mixtos. Se basa en la detección de la actividad enzimática de las levaduras mediante la hidrolisis de sustratos cromo- génicos que darán un color específico si la enzima está presente.
La peptona es la fuente de nitrógeno en el medio, la glucosa es la fuente de energía. La diferenciación entre las especies del género Candida se logra a través de los sustratos cromogénicos contenidos en el medio de cultivo, sobre los que actuarán las enzimas hexosaminidasa, glucosidasa y fosfatasa alcalina
Verde: C, albicans
Azul: C, tropicali
Rosadas: C, krusei
¿Cuál es la función del tween80 en los medios de cultivo para hongos?
En los medios de cultivos para hongos el Tween 80 (o polisorbato 80) es agregado estimular la formación de Clamidoconidias, esto gracias a la presencia de ácidos oleicos.
Cual es la sensibilidad del KOH al 10% para la identificación de hongos en los exámenes directos?
Alta en el diagnóstico de las onicomicosis 61% y en la pitiriasis versicolor 78%
Baja en histoplasmosis y neumocistosis
BIBLIOGRAFÍA:
Gómez B, Tobón A y Restrepo A. Fundamentos de las micosis humanas. Corporación de investigaciones biológicas. Primera edición. 2018
Arenas R. Micología Médica. McGraw-Hill Interamericana. Quinta Edición. 2014
Bonifaz A. Micología Médica Básica. McGraw-Hill Interamericana. Cuarta edición.
Arango M. y Castañeda E. Micosis Humanas:Procedimientos de diagnóstico. Exámenes Directos CIB – INS. 2003
Kwon-ChungK. Medical Mycology. Lea y Febiger. Philadelphia – London 1992
López R. Micología Médica: Procedimientos para el Diagnóstico de laboratorio. México: Editorial Trillas; 2012
Micología Médica. Manual de Laboratorio. Universidad de Antioquia. Facultad de Medicina. Departamento de Microbiología y Parasitología
Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiología Clínica. Disponible en: http://www.seimc.org/contenidos/gruposdeestudio/gegmic/dcientificos/documentos/gegmic_dyc1_2004.pdf
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